[核酸扛原检测]核酸、抗原、抗体检测，三种新冠检测方式有何差别？

自 2020 年新冠禽流感爆发以来，「多肽检验」做为一项检验与否病毒感染的重要指标，开始反复再次出现在他们的生活中。2022 年 3 月 10 日，国务院应对新式冠状病原体体肺结核禽流感共管共管机制综合组发布通知，决定推进「抗原筛检、多肽诊断」的检验模式，在多肽检验基础上增加抗原检验做为补充。

抗原检验是什么？和其他的检验方式有什么不同？这首诗，他们以新式冠状病原体体为例，谈谈常见的快速筛检方式，谈谈相关的原理和通则。

想要对一类病症或者一类化学物质展开筛检，他们首先要搞清楚的是「从何脱身」的难题，其次是「如何检验」，让discussed的变动反映到他们眼前，帮助他们作出判断。

他们面对的是病原体体。根据我们脍炙人口的小学沙旺热县科学知识，病原体体是一类由遗传信息和蛋白机壳组成的类有机体。假如想对病原体体的病毒感染情况展开观测，就需要从它的混合物脱身。接下来的内容，希望我们带着自己小学的细菌科学知识阅读。

以目前正在所苦他们的 SARS-CoV-2?为例。它属于冠状病原体体防已科下，冠状病原体体总科的甲型冠状病原体体属，是已知的Pudukkottai能病毒感染人类的冠状病原体体。所有的冠状病原体体都是具有内皮细胞的公义双链 RNA 病原体体，也是说，它们的遗传信息是一条单独的 RNA 链，并且这条 RNA 链可以直接做为 mRNA（旅行者 RNA）参与译者，指导蛋白的合成。

序号为NPRC 2020.00002的毒种，图片由国家病原体微细菌深外（中国病症防治指挥中心病原体体病防治控制所）提供。来源：http://nmdc.cn/nCoV

他们现在的目的是检验化石中与否存在这种病原体体，无论是检验它本身，还是检验病原体体带来的产物，能脱身的方向也是两种：蛋白机壳（内皮细胞）、遗传信息。

顺着这个逻辑，那最不言而喻的方式是检查它「能不能看到」，但病原体体既存小得很，SARS-CoV-2 的直径在 80-120 nm，要想每个化石都拿电子显微镜过一遍是不现实的，物力和物力都这么一来。所以更经济超值的方式，是通过这类措施，让病原体体的混合物，或者因为病原体体而再次出现的这类特殊化学物质积蓄到一定量级后萤光、变黑，再次出现宏观经济表现。

所以他们的难题就转换成了，优先选择一类可以观察到宏观经济孔径变动的方式，和病原体体的混合物、病原体体引发的某种化学物质造成关连。他们能优先选择的化学物质也摆到台面上：病原体体的遗传信息，在这里是它的 RNA；病原体体的内皮细胞，也是蛋白机壳；和，假如你还记得一些基础的细菌科学知识，人体的免疫会在病毒感染病原体体之后造成抗原以抵抗入侵，它也是不错的取材。

他们目前采用的几种检验方式，也就从这些化学物质（和它们的相关化学物质）脱胎而来，分别为针对遗传信息的多肽检验，针对内皮细胞的抗原检验，和针对抗原的血清抗原检验。

做为病原体体的遗传信息，多肽序列载写了能鉴定病原体体为某一特定种的基因特征，因此多肽阳性，也就意味着病原体体在体内存在过。

他们目前展开的「多肽检验」其实分为两个部分。平常他们展开的「捅鼻子」「捅嗓子」取样和后续的定性是第一部分。在取得化石之后，因为病原体体量太少，样本会在实验室中展开一定次数的扩增，并根据荧光反应结果来判定阳性阴性。

第二部分，确定为阳性的样本，还需要通过基因测序，确定样本病原体体的分型，以便溯源。这一步已经不属于日常筛检的范畴，但在流行病学调查上具有重大意义，假如有兴趣了解，可以参看 Wikipedia 简要了解。

他们平常参与的做为筛检工具的多肽检验，指的是采集到定性的第一部分。

在病毒感染了 SARS-CoV-2 之后，咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、血液等化石中均可发现病原体体多肽。不同部分化石多肽检验的阳性率有一定差异，随着病程进展，各个部位的检出率也会发生变动。

他们习惯称呼的「鼻拭子」与「咽拭子」，其实都是采集咽腔后壁的分泌物与组织，前者采集鼻咽，后者采集口咽。也有采用其他标准的，比如唾液等亦可做为检验化石，本质上也是不同地区规定有差异

鼻（咽）拭子与（口）咽拭子已经是综合了阳性率与便利程度的考量。粪便和尿液等其实也可以做为化石采集的对象。而且根据一项对 31 例患者的研究，肛拭子的准确率要高于鼻咽与口咽采样，尤其病程后期，肛拭子确诊病例的鼻拭子阳性率不到 30%。但显然，由于操作的限制，它无法做为早期筛检的首选方式。

接下来的工作，是从获取的那一点点化石中提取多肽。由于样本中病原体体的量级很小，不足以拿来分析，还需要将其扩增并标记。需要用到的同样是高小学过的科学知识：聚合酶链式反应（PCR）——这一步看起来麻烦，但由于它的原理和工序已经研究成熟，实际操作中只需要加好试剂送机器，整个多肽检验的过程里最麻烦的还是让待测者安安分分弄来化石（笑）。

各地疾控机构或检验中心会采购合适的多肽提取试剂盒与多肽检验试剂盒。提取试剂盒负责将 RNA 从混杂的样本（细胞碎屑、分泌物、灰尘等杂质）中提取出来，常见的有磁珠法、离心柱法和释放剂法，不同提取方式可能对后期检验的准确度略有影响。之后，提纯出的 RNA 就会移交给检验试剂盒（也有一些试剂盒将两者合一），展开之后的工序。

检验试剂盒带着样本在机器中展开的过程，是这个检验中最主要的反应：RT-qPCR（实时定量逆转录聚合酶链反应）。

接下来需要你捡起高中细菌的科学知识。一般的 PCR 反应有以下几步：

加热：让双链 DNA 解旋变形，成为两条双链；退火：让混合的双链 DNA 与根据需要复制的片段而设计好的引物结合；延伸：调整温度，让 DNA 聚合酶顺着引物开始工作，复制出新链，形成新的双链。

在对病原体体的观测中，他们要做的工作也无非上面几步，只是需要多出两样东西：

在第一次反应之前，使用逆转录酶（依赖 RNA 的 DNA 聚合酶），合成病原体体双链 RNA 的互补链，组合成 cDNA；在退火与延伸的阶段，除了引物和所需的酶外，还需要 TaqMan 探针。

你可以把 TaqMan 探针这样理解：它的主体部分是一段寡核苷酸链，被设计成能和一小部分需要复制的基因片段配对成双链的样子；它一端接了一个荧光分子，另一端接了一个开关（淬灭基团），两者和探针相连时，荧光就会被淬灭基团压制，观测不到。退火时，这个探针会和引物一起结合在要复制的双链片段上。在延伸的过程中，DNA 聚合酶会把挡在面前的障碍物切碎，其中就包括这段探针，淬灭基团和荧光分子就这样分离，荧光就表现出来。

图源：Grace Adams; A beginner’s guide to RT-PCR, qPCR and RT-qPCR. Biochem (Lond) 22 June 2020; 42 (3): 48–53. doi: http://doi.org/10.1042/BIO20200034

随着循环数的增多，扩增的 DNA 片段和荧光也越来越多。对比每个循环的荧光亮度和前若干次循环的基准亮度，他们就能得出目前的 DNA 片段量，也可以直接用循环数和荧光亮度做定性的判断。

所以具体复制哪一部分呢？既然要观测病原体体，那他们就选取最有代表性的多肽片段。现行的标准中，ORF 基因与 N 基因是常用的检验位点。

检验试剂盒负责的是将提取出的 RNA（样本）投入后，根据试剂盒上的程序说明，设定对应的 PCR 温度与时长，由机器控制完成扩增过程，在固定的环节收集荧光信号，记录对应的循环数（Ct 值）。判断阴性阳性 / 与否还具有传染力的标准，是看荧光信号达到阈值时，目前循环数是多少。根据目前现行的《新式冠状病原体体肺结核诊疗方案（试行第九版）》，解除隔离管理的标准为 Ct 值 ≥ 35。和此前通行的 ≥40 标准相比，出院与解除隔离的时间会大大缩短。

经 RT-PCR 的多肽检验到现在都是确诊的金标准，因为它在方式学的角度看来，（理论上）可以做到 100% 准确。但多肽检验耗时长、对环境与操作人员要求高，在环境条件达不到标准、物资与仪器不齐全等情况下，大批量的多肽检验会带来巨大人力与物力消耗。

在本次禽流感中，他们采用的免疫测定包括了快速抗原检验与抗原检验，它以抗原-抗原反应为基本原理，旨在通过抗原与抗原快速的中和效应，以较少的时间成本观测样本中与否存在待测物。两者都属于免疫层析法的范畴。

以盒装方式再次出现、可以自行操作的抗原检验就很适合做为物资不足、自我测定等情况下的补充。

多肽检验检查的是病原体体的（标志性）遗传信息，是病原体体的「内里」。所以（快速）抗原检验检查的是病原体体的「外在」，直接检查完整的病原体体颗粒。目前通过审批的抗原检验试剂盒包括四种类型：胶体金法、乳胶法、荧光免疫层析法。三者内在原理一致。但其中荧光免疫层析法试剂盒仍然需要专用的检验仪或紫外线手电，不适合家庭自测；胶体金法和乳胶法则都是将检查结果转换成肉眼可见的条带，差别在于用于标记上色的化学物质不同。

当然，抗原检验自然有它的劣势在，它的假阴性率（是阳性但显示阴性）要更高，可能导致漏检错检。但放在一杯茶就能出结果的时间优势面前，准确性上的差距在这类特定情况下可以暂时让步。

图源：How the SARS-CoV-2 EUA Antigen Tests Work | ASM.org

和多肽检验相比，抗原检验增加了「鼻拭子」这一采样途径，降低了个人自测的难度。拭子上的样本在缓冲液中洗脱，取液体滴加在加样孔后，液体会因为毛细作用，带着潜在的抗原，经过一片预载了抗原的区域（结合垫，conjugate pad）。

这片区域上的抗原，是抗目标抗原（SARS-CoV-2）的单克隆抗原，每一个抗原分子都和特别的标记结合，它们与样本中的抗原发生反应，形成抗原-抗原复合物，并随着毛细作用向下一条带流去。

紧接着经过的是检验线（T 线，test line），在检验线上附着的同样是抗目标抗原的单克隆抗原，你可以理解成这里的东西和结合垫上的一样，只是没带标记。此时，假如受测者已经病毒感染了 SARS-CoV-2，他留在样本中的抗原形成的抗原-抗原复合物，会在此处与固定在线上的抗原再次结合。在这里，这些带着标记的复合物不断沉积，最终会显示出一条或深或浅的条带。条带的颜色来源，是之前结合垫上的抗原分子附着的标记，在胶体金法中是胶体状态的金颗粒，在乳胶法中是上色的乳胶滴，在荧光法中是荧光分子。所以你在使用这类试纸时，会发现刚刚加样结束，液体刚开始扩散的时候，扩散的最前端会有一点点很淡的颜色不断推移，这是还没有固定沉积的标记的颜色。

接下来，液体继续扩散，经过质控线（C 线，control line），在质控线上附着的是另一类抗原——『抗「抗目标抗原的单克隆抗原」的单克隆抗原』，简称「二抗」。这种新的抗原是让上一类抗原在另一类动物的免疫中反应得来的，比如结合垫的抗原来自兔，那这里的抗原就来自羊，是羊抗兔的单克隆抗原。也是说，二抗的抗原是之前在结合垫上的抗原。这条线是为了检验液体有没有正常扩散、结合垫上的抗原有没有失效等等而存在的。此时，液体中剩余的大量来自结合垫的抗原就会做为抗原，与质控线上的二抗发生抗原抗原反应，形成复合物，显出一条明显的条带。

由于结合垫上的抗原非常充裕，这条质控线条带会再次出现得非常快、非常显色，而检验线由于抗原（病原体体）数量不一定，显色速度会有差别，但一般在 15 分钟内就足够判断结果。所以不要看 C 线很明显，T 线隐隐约约就觉得「没事了」，T 线不管深浅，只要有，是阳性。

具体操作方面，可以参考医政医管局发布的 教学视频。目前国家也在逐步推广抗原自测试剂盒，在一定程度上可以减轻未来医疗与街道的压力。

除了前两种检验方式外，还有一类使用不太多，但同样重要的检验方式，是同属免疫测定方式的「血清抗原检验」。

抗原检验采用的试剂盒与抗原检验非常接近，但化石的限制更大——由于检验的对象变成了抗原，化石就必须是明确有抗原存在的血液（或血浆、血清）。而且人体在初次病毒感染病原体体后，并不会第一时间内造成抗原。抗原能明确达到被检验的量级，一般是在初次病毒感染（或接种疫苗）的一到两周之后。这些条件限制了抗原检验不能做为确诊性质的检查。目前，血清抗原检验仅做为一定情况下检查疫苗与否生效，或查验受测者近期与否病毒感染过新冠病原体体的方式。

在人体中有五种抗原，分别是 IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM。IgA 主要负责黏膜免疫。IgD 与免疫反应激活有关。IgE 抵御寄生虫，同时也参与过敏反应。剩下的 IgG 与 IgM 是对抗病原体体的过程中，免疫派出的主力军。

SARS-CoV-2 做为病原体体，人体经刺激主要分泌的是 IgG 与 IgM 两种。现有的抗原检验试剂盒，主要也是针对人体对 SARS-CoV-2 的 N 蛋白（核衣壳蛋白）或 S 蛋白（刺突蛋白）造成的 IgG 与 IgM。

抗原试剂盒的检验装置外观和抗原检验别无二致。二者的差别是上文中提到的结合垫、检验线、质控线上附着的化学物质。

图源：IgG and IgM rapid diagnostic test for COVID-19 by Partynia Wikipedia - Serology

这次，加样孔中滴入的样本可能有对 SARS-CoV-2 的抗原。因此，结合垫上就应当是带了标记物的抗原——当然不可能放活病原体体上来。一般这里使用的都是设计检验的抗原蛋白，比如前文提到的 N 蛋白或 S 蛋白，或者重组病原体体，无论是哪种，它都必须包含受体结合域（RBD）做为抗原结合的靶点。在检验线上，附着的是抗 IgM 或抗 IgG 抗原，以捕获结合了抗原的抗原蛋白。最后，质控线上附着抗原的特异性抗原，捕获剩余的游离抗原。

总的说来，四种检验方式针对的是不同的需求，互有优势，互相补充。多肽检验做为金标准，直接查验病原体体的 RNA，负责看被检者带不带病原体体；抗原检验做为快速检验方式，查的是病原体体的蛋白，但准确度不如多肽检验，对传染力强的病毒感染者更有效；抗原检验查的是疫苗有没有生效、人近期有没有病毒感染过病原体体。

近期，新冠禽流感在各地卷土重来。Omicron 变种与此前流行的 Delta 变种相比，虽然病死率与重症率明显下降，但潜伏期更短，病原体体复制速度更快，传染力明显增强。希望我们在这样的环境中保持健康。

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